在显微镜检查中,景深常被看做经验参数。在实际操作中,会根据数值孔径、分辨率和放大率之间的相关性确定该参数。为了获得最佳视觉效果,现代显微镜的调节设备在景深和分辨率之间实现了最佳平衡,这两个参数在理论上呈负相关。
人眼景深实际值
DIN/ISO标准将物体侧面的景深定义为“物体平面两侧空间的轴向深度,物在该深度范围内移动时没有可检测到的图像清晰度损失,且图像平面和物镜的位置保持不变”。
然而,该标准没有给出任何关于焦点虚化检测阈值的测量方法。Max Berek是首位就人眼景深发表文章的作者,早在1927年,他就已经将自己通过广泛实验获得的结果公布于世。Berek公式给出了人眼景深的实际值,至今仍在沿用。简化公式如下:
TVIS = n [λ/(2 × NA?) + 340 μm/(NA × MTOT VIS)]
TVIS:人眼景深
n:物体所处介质的折光率。如果物体移动,则将导致工作距离变化的介质折光率代入等式。
λ:所用光源的波长,如果是白光,λ = 0.55 μm
NA:物体侧面的数值孔径
MTOT VIS:显微镜的总视角放大率
如果在上述等式中,将总视角放大率替换为有效放大率(MTOT VIS=500至1000×NA),可以看出,采用一级近似值时,景深与数值孔径的平方成反比。
在放大率低时,缩小光圈(即减小数值孔径)可以显著延长景深。一般可用孔径光阑或共轭平面上的光阑来完成这一操作。但数值孔径越小,横向分辨率越低。
因此,问题在于如何根据物体结构找到分辨率和景深之间的最佳平衡点。借助高分辨率物镜(高NA)和可调孔径光阑,现代光学显微镜能够根据特定样品的要求灵活匹配光学器件。在立体显微镜中,考虑到三维结构中z维度的要求,通常需要作出一些妥协以获得更长景深。
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